MANCINI GIULIA
Mancini Giulia
Ruolo:
Dottorando/a
Struttura di afferenza: CLASSE SUV

Biografia

Nell’ a.a. 2017/2018 ho conseguito la Laurea Triennale in Scienze Biologiche, presso l’Università degli Studi dell’Aquila, con tesi compilativa dal titolo “La funzionalità selettiva e il meccanismo molecolare della dietilamide dell’acido lisergico (LSD)”, nella quale ho spiegato la conformazione e la dinamica molecolare del complesso l’LSD /recettori serotoninergici. Nell’ a.a. 2020/2021 ho conseguito la laurea magistrale in Molecular Biology and Genetics, presso l’Università degli Studi di Pavia, con tesi sperimentale dal titolo “Expression, purification and characterization of antigen5-3, a salivary protein from Aedes albopictus”. Antigen5-3 è una proteina presente esclusivamente nella saliva di femmine di zanzara, il quale ruolo è legato all’inibizione della coagulazione al sito di puntura e all’agevolazione dell’infezione da parte di flavivirus. La rilevanza di questo studio è collegata a chiarire i meccanismi legati all’ematofagia, alla luce del ruolo di A. albopictus come vettore di organismi patogeni per l’uomo.

La mia attività di ricerca presso il laboratorio Armenise-Havard di Biologia Strutturale, sotto la supervisione del professore F. Forneris,è stata completamente dedicata allo studio di due proteine trovate esclusivamente nella saliva di esemplari femmina di Aedes albopictus, anche conosciuta come zanzara tigre. La saliva delle zanzare femmine, in particolare, ha una composizione molto complessa e ciò è correlato alle numerose funzioni ad essa associate quando inoculata nella pelle del soggetto punto. Infatti, la saliva contiene sostanze in grado di modulare molte risposte dei vertebrati alla puntura, come quella emostatica, infiammatoria e immunitaria. Inoltre, è rilevante sottolineare che nella saliva sono presenti molte proteine implicate nella trasmissione di patogeni, come virus e protozoi (ad esempio Plasmodium falciparum, agente responsabile della malaria), di cui la zanzara è un vettore fondamentale.        
In particolare, in continuità con il lavoro che ho svolto durante l’internato di tesi magistrale nel laboratorio Armenise-Havard, ho continuato a studiare la proteina antigen5-3 (aaAG5-3), appartenente alla famiglia delle proteine Antigen-5, che sono presenti ubiquitariamente nei Ditteri ematofagi. La sua funzione non è ancora chiara, ma recenti studi su proteine simili, presenti in specie legate ad A. albopictus, hanno rivelato una sua possibile interazione con eparina e ioni bivalenti. Inoltre, è stato scoperto che queste proteine, iniettate nella pelle dei vertebrati da zanzare infette, promuovono la trasmissione di alcuni flavivirus, come i virus Dengue e Zika.
Il mio studio su questa proteina si basa su un approccio innovativo che pone le prime basi sulla caratterizzazione molecolare di aaAG5-3, sia dal punto di vista strutturale che biofisico, con lo scopo di fornire nuove conoscenze per combattere la diffusione di virus, controllando questa specie che funge da loro vettore. 
Inizialmente ho ottimizzato una strategia per produrre, su larga scala, la proteina ricombinante aaAG5-3, utilizzando come cellule di espressione le E. coli T7 Shuffle K12, in modo da ottenere una quantità di proteina sufficiente per eseguire gli studi successivi. Le tecniche di purificazione di aaAG5-3 che ho ottimizzato prevedono la combinazione di diverse strategie, come la cromatografia di affinità, in cui si sfrutta la presenza di un tag di istidine, fuso alla proteina di interesse, che interagisce con ioni nickel presenti sulla matrice della colonna cromatografica usata. La procedura è poi seguita da una strategia inversa a quella precedentemente utilizzata, in cui lo stesso setting è invertito per ottenere la proteina privata dal tag. A questo, segue la cromatografia per esclusione molecolare, in modo da arrivare ad ottenere esclusivamente la proteina pura, escludendo eventuali contaminanti. 
Il fine di questo è ottenere campioni di proteina pura da utilizzare per studi strutturali e biofisici, come la fluorimetria a scansione differenziale (DSF), il Multi Angle Laser Light Scattering (MALLS) e la diffrazione di raggi X a piccoli angoli (SAXS), tramite i quali ho studiato l’interazione di aaAG5-3 con ioni bivalenti, ottenendo risultati piuttosto rilevanti utilizzando il calcio, implicato nella cascata di coagulatione. Infatti, il calcio sembra stabilizzare la proteina, riducendone anche la flessibilità. Oltre a questi studi biofisici, mi sono anche concentrata sul riuscire ad individuare delle appropriate condizioni per favorire la crescita di cristalli della proteina aaAG5-3, sempre in continuità con quanto iniziato nell’internato di tesi. Dopo oltre due anni e centinaia di condizioni di cristallizzazione testate, solo recentemente sono arrivata ad ottenere importanti informazioni utili alla risoluzione della struttura di questa proteina. 
Parallelamente allo studio su aaAG5-3, lavoro su Labrum-Interacting Protein from Saliva-2 (LIPS-2), una proteina contenuta nella saliva di zanzare femmine della specie A. albopictus. In continuità e in collaborazione con il lavoro del Dottor P. Gabrieli, ho iniziato a lavorare sul progetto LIPS-2 per studiare e confermare l’interazione di questa proteina salivare con una proteina cuticolare (Cp19), trovata nella punta del labrum delle zanzare. Presumibilmente, quest’interazione è implicata nell’attivazione del meccanismo di probing della zanzara e comporta modificazioni morfologiche del labrum stesso. Brevemente, LIPS-2 è una proteina globulare monomerica che si trova esclusivamente nel sialoma delle femmine di zanzara della specie Aedes ed è essenziale per l’attivazione del meccanismo di probing, tramite il quale le zanzare ricercano e trovano capillari nella pelle degli organismi attaccati.     
Per chiarire i meccanismi alla base dell’interazione tra LIPS-2 e Cp19, ho innanzitutto sviluppato un protocollo di espressione e purificazione per Cp19, un lavoro non semplice dal momento che non sono disponibili informazioni in letteratura nell’ambito di proteine cuticolari d’insetto. Dopo moltissimo tempo e numerose prove, ho stabilito un protocollo d’espressione che coinvolge l’utilizzo di cellule di E. coli T7 Shuffle K12, seguito da procedure di purificazione molto particolari, per ottenere la massima quatità di proteina da poter usare nei successivi saggi. Tra le varie difficoltà legate alla purificazione di Cp19, le più ardue da risolvere sono state: la sua bassa espressione, l’attitudine a precipitare anche a basse concentrazioni e la tendenza a creare interazioni aspecifiche con diverse resine di colonne cromatografiche. 
Una volta ottenuta una quantità significativa di Cp19, ho utilizzato questa proteina, assieme a LIPS-2, per svolgere dei saggi volti a caratterizzare la loro interazione da un punto di vista quantitativo e qualitativo: ho svolto saggi di coeluizione in MALLS e esperimenti basati sul fenomeno di microscale thermophoresis (MST). In particolare, utilizzando in MST Cp19 e LIPS-2, fusa con la proteina GFP, ho ottenuti risultati quantitativi sull’interazione tra le due, confermandola e definendone la costante di affinità nel range del nanomolare. Inoltre, tramite questi saggi di MST, ho potuto confermare la specificità dell’interazione LIPS-2/Cp19, utilizzando anche dei mutanti di LIPS-2 che compromettessero la regione che ipotizziamo sia coinvolta nell’interazione, dopo aver stabilito, anche per loro, protocolli di espressione e purificazione. Attualmente il mio prossimo obiettivo per questo progetto è di conoscere a livello strutturale come avviene questa interazione, un progetto che richiede necessariamente una migliore ottimizzazione del processo di purificazione di Cp19.